酵母菌种质资源数据质量控制规范(草稿)
起草单位:中国食品发酵工业研究院
目 次
前 言............................................................................. 107
1 范围........................................................................................................................................... 108
2 规范性引用文件.......................................................................................................................... 108
3 数据质量控制规范制定的原则和方法.......................................................................................... 108
4 基本信息.................................................................................................................................... 108
5 培养特征信息.............................................................................................................................. 111
6 生理生化实验............................................................................................................................. 115
7 遗传学信息................................................................................................................................. 120
8 其它........................................................................................................................................... 125
9 附录I:...................................................................................................................................... 126
参考文献........................................................................................................................................ 127
前 言
本规范由微生物菌种资源平台建设项目提出。
本规范起草单位:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国兽医药品监察所、中国食品发酵工业研究院。
本规范主要起草人:程池、李金霞、姜瑞波、周宇光、朴春根、叶强、张月琴、陈敏等。
酵母菌菌种资源数据质量控制规范
1 范围
本规范规定了酵母菌菌种资源数据采集过程中质量控制的内容和方法。
本规范适用于酵母菌菌种资源的整理、整合和共享。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本规范,然而,鼓励根据本规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本规范。
ISO 3166 Codes for the Representation of Names of Countries
GB/T 2659 世界各国和地区名称代码
GB/T 2260 中华人民共和国行政区划代码
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
GB 7714-1987 文后参考文献著录规则
《病原微生物实验室生物安全管理条例》
3 数据质量控制规范制定的原则和方法
3.1 采集的数据应具有系统性、可比性、稳定性和可靠性。
3.2 数据质量控制以过程控制为主,兼顾结果控制。
3.3 数据质量控制方法应具有可操作性。
3.4 鉴定评价方法以现行国家标准和行业标准为首选依据;如无国家标准和行业标准,则以国际标准或国内比较公认的先进方法为依据。
4 基本信息
4.1 平台资源号
平台资源号由两部分组成,即:资源保藏单位/人编号(9位)+ 本单位/人保藏的资源流水号(9位)。其中资源保藏单位/人编号规则为:微生物菌种资源分类编号(15)+单位所在区域编号(2位)+资源单位性质代码(P或C)+资源保藏单位/人序号(4位)。其中单位所在区域编号见附录A,资源单位性质代码P(Person)表示资源提供者是自然人,C(Corporation)表示资源提供者是法人实体。后9位流水号从“000000001”到“999999999”。平台资源号具有惟一性。
如“1511C0005000000001”,其中“15”代表微生物,“11”代表北京,“C”代表法人实体,“0005”代表中国工业微生物菌种保藏管理中心,“000000001”代表工业微生物子项目进入国家科技基础条件平台的第1株菌的流水号。
4.2 菌株保藏编号
酵母菌菌种资源在保藏机构的保藏编号,由前缀和菌株编号两部分组成。前缀为保藏机构名称的英文缩写,前缀和菌株编号之间留半角空格。如“CICC 1001”,其中“CICC”为“中国工业微生物菌种保藏管理中心”的英文缩写;“1001”是菌株在中国工业微生物菌种保藏管理中心的编号;“CICC”和 “1001”之间有一半角空格。
4.3 中文名称
酵母菌菌种资源的标准中文译名,参照1986年由科学出版社出版的《真菌名词及名称》,如没有译成中文可填写“暂无”。
4.4学名
酵母菌菌种资源的学名,包括属名、种名加词、定名人及定名年份。
酵母菌菌种资源的拉丁属名,如“Candida”,注意第一个字母大写和斜体;酵母菌菌种资源的拉丁种名,如“tropicalis”,如果为变种,以“种名加词+半角空格+var.+变种加词”表示,如“shehatae var. shehatae”;如果为亚种,以“种名加词+subsp.+亚种加词”表示;如果菌种只鉴定到属,未确定种名,种名加词以“sp.”(正体字)表示。注意斜体、正体和空格。
4.5 其他保藏机构编号
酵母菌菌种资源在其他菌种保藏中心的保藏编号,编号前以“=”号开头,如“=NRRL Y-2460=ATCC 32691”。注意保藏中心缩写和菌株编号之间有半角空格,“=”号前后无空格。
4.6 来源历史
酵母菌菌种资源在各收藏单位之间的转移情况,收藏单位前以左指向“←”表示。如“←上海工业微生物研究所←上海酵母厂”。
4.7 原产国或地区
酵母菌菌种资源分离基物采集地所在国家、地区或国际组织名称。国家和地区名称参照ISO 3166和GB/T 2659。如该国家已不存在,应在原国家名称前加“原”,如“原苏联”。国际组织名称用该组织的外文名缩写。
4.8 采集时间
采集分离样品的具体时间,格式为YYYYMMDD,其中YYYY为年份,MM为月份,DD为日,如1999年2月9日表示为“19990209”,如只有年份或月份,则表示为“19990000”或“19990200”。
4.9采集地区
酵母菌菌种资源分离基物采集地的省份和县的名称,省份名称和县名称参照GB/T 2260。
4.10 采集地生境
对酵母菌菌种资源分离基物采集具体地点的生境类型,如陆地、海洋、湿地、河流、森林、工厂、医院、住所等进行详细描述,如为极端环境,也应详细描述。
4.11 分离人
酵母菌菌种资源分离者的姓名,姓在前,名在后。
4.12 分离时间
分离酵母菌菌种资源的具体时间,格式为YYYYMMDD,具体表示方法同“4.8”。
4.13 分离基物
指酵母菌菌种资源的最初分离基质名称,如“污泥”。
4.14 鉴定人
酵母菌菌种资源鉴定者的姓名,姓在前,名在后。
4.15 鉴定人所在单位
鉴定酵母菌菌种资源的个人所在单位的名称,应写全称,如“中国食品发酵工业研究院”。
4.16 鉴定时间
鉴定酵母菌菌种资源的具体时间,格式为YYYYMMDD,具体表示方法同“4.8”。
4.17 原始编号
酵母菌菌种资源的最初分离编号。
4.18 收藏时间
保藏机构最初收藏酵母菌菌种资源的具体时间,格式为YYYYMMDD,具体表示方法同“4.8”。
4.19 培养基编号
最适合酵母菌菌种资源生长的培养基的统一编号,具体表示方法为“CM+4位编号”,如“CM0077”。
4.20 培养温度
最适合酵母菌菌种资源生长的温度,以“℃”表示。
4.21 资源归类编码
酵母菌菌种资源所在属在国家自然科技资源平台资源分级归类与编码标准中的11位编码,参见《自然科技资源共性描述规范》。
4.22 模式菌株
指明该酵母菌菌种资源是否为模式株。
1:模式菌株
2:非模式菌株
4.23 生物危害程度
参照《病原微生物实验室生物安全管理条例》,指明该酵母菌菌种资源所属的生物危害程度。
1:一类
2:二类
3:三类
4:四类
5:不清楚
4.24 分类地位
指明该酵母菌菌种资源所属的界、门、纲、目、科、属、种的拉丁名称,其中属和种用斜体字,其他为正体,注明采用的分类系统(或列出分类鉴定的参考文献)。
5 培养特征信息
5.1 液体宏观培养特征
将酵母菌菌种划线接种于麦芽汁琼脂培养基上,25℃培养2~3d进行活化。将新鲜有活力的菌种细胞接种到装有30mL培养基的塞有棉塞的100mL三角瓶中,或装有5mL培养基的直径为16mm的试管中,25℃培养2~3d。常用培养基为麦芽汁培养基(Malt extract ),葡萄糖-蛋白胨-酵母提取物(Glucose-peptone-yeast extract broth)和YM培养基(Yeast extract malt extract broth)。
观察培养好的酵母菌菌种资源的宏观形态,底部有无沉淀及其质地,致密、粘稠或絮状;是否产生菌环、菌岛、菌醭或菌膜,如果形成菌醭或菌膜,观察其厚薄、干燥、湿润、暗淡、反光、光滑的、褶皱的或沿三角瓶的边缘向上生长。
培养基配方:
麦芽汁培养基:将麦芽提取物稀释至10°波美度,115℃湿热灭菌15min。
葡萄糖-蛋白胨-酵母提取物培养基:将20g葡萄糖、10g蛋白胨和5g酵母提取物溶于1L去离子水中。121℃湿热灭菌15min。
YM培养基:将3g酵母提取物、3g麦芽提取物、5g蛋白胨和10g葡萄糖溶解在1升水中,培养基的pH值因培养基成分的批次不同而在5~6之间浮动,121℃湿热灭菌15min。也可用市售的Bacto YM Broth(Difco)代替。
5.2 细胞形状
参照一般微生物菌种实验操作书,将5.1中培养好的酵母菌菌种制作水浸片或0.1%美蓝染色水浸片,在600×放大倍数下观察细胞形状,与第9版《Dictionary of the Fungi》上标准图片进行比对,按照最大相似原则,确定其细胞形状是球形、亚球形、柠檬形、椭圆形、卵圆形、柱状、棒状、杆状、长杆状、针形、螺旋形、新月形、三角形、瓶形或其他形状。
5.3 细胞大小
随机选取20个5.1中培养好的酵母菌菌种的单细胞,利用显微测微尺或测量软件,对菌体细胞的长度和宽度进行测量,将两端的值记录下来,单位为μm,精确到0.01μm,例如“(3.48—5.22)×(4.72—6.95)”。
5.4 无性繁殖方式
在显微镜下观察5.1中培养好的酵母菌菌种的无性繁殖方式,是芽殖、裂殖、芽裂殖还是产生无性孢子。如果是芽殖,需指明是一端芽殖、两端芽殖还是多边芽殖。
5.5 无性孢子类型
酵母菌菌种资源经5.1和5.6方法培养后,如果无性繁殖方式产无性孢子,指明其无性孢子的种类是芽生孢子、节孢子、厚垣孢子、掷孢子、内生孢子或分生孢子。
5.6 菌落质地
将酵母菌菌种划线接种于麦芽汁琼脂培养基上,25℃培养2~3d进行活化。挑取活化好的菌体接种于新鲜麦芽汁琼脂(Malt extract )、YM琼脂(yeast extract-malt extract agar)或葡萄糖—蛋白胨—酵母提取物琼脂(Glucose-peptone-yeast extract agar)上,25℃培养1~7d,一般培养2~3d即可。
采用目测法观察经过标准条件培养的酵母菌菌种资源的菌落质地,是否为黏液样状、流动状或粘滞状、黄油状、松脆状或膜状。
培养基配方:
麦芽汁琼脂:10°波美度麦芽汁1L,20g琼脂,115℃湿热灭菌15min。
YM琼脂:将3g酵母提取物、3g麦芽提取物、5g蛋白胨、10g葡萄糖和20g琼脂溶解在1升水中,培养基的pH值因培养基成分的批次不同而在5~6之间浮动,121℃湿热灭菌15min。也可用市售的Bacto YM Broth(Difco)再添加2%的琼脂代替。
葡萄糖—蛋白胨—酵母提取物琼脂:将20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物和20g琼脂溶于1L去离子水中。121℃湿热灭菌15min。
5.7 菌落颜色
采用目测法观察5.6中培养好的酵母菌菌落的颜色,有乳白色或奶油色、红色、橙色、黄色或粉红、玫红等,注意是否有其他如黄色、橙色、灰色等色调。
5.8 菌落表面
采用目测法观察5.6中培养好的酵母菌菌落的表面,是否为反光或暗淡,光滑,粗糙,条纹,褶皱状,脊状或疣状。
5.9 菌落隆起
采用目测法观察5.6中培养好的酵母菌菌落是平伏还是隆起。
5.10 菌落边缘
采用目测法观察经标准条件下培养的酵母菌菌种资源的菌落边缘,与《Dictionary of the Fungi》上标准图片进行比对,按照最大相似原则,确定其边缘是平滑、全缘、波浪状、裂叶状、蚀刻状或流苏状。
5.11 菌丝形态
将酵母菌菌种划线接种于麦芽汁琼脂培养基上,25℃培养2~3d进行活化。将活化好的菌株接种在玉米粉琼脂(Corn meal agar)Dalmau平板培养基上,接种前预先将平板放置1~2d使表面干燥,接种方法为:在平板的一边相当于表盘10点至2点的位置划单线接种,在平板另一边相当于表盘4点和8点的位置处接种两个点,然后,在单线接种的中间盖上一片无菌盖玻片,在点接种的一个点盖上一片无菌盖玻片,于25℃下培养4~7d后直接在显微镜下观察,有无形成菌丝,是真菌丝还是假菌丝。
玉米粉琼脂:将42g玉米粉加入1L去离子水中60℃加热1h,用滤纸过滤再加水至1L。加入12g琼脂溶解。121℃湿热灭菌15min。或使用Bacto CMA(Difco)代替。
5.12 有性繁殖方式
将酵母菌菌种划线接种于麦芽汁琼脂培养基上,25℃培养2~3d进行活化。然后挑取少量菌体转接至产孢培养基上,产孢培养基有:醋酸盐琼脂培养基I(Acetate agar I)、醋酸盐琼脂培养基II(Acetate agar II)、5%麦芽汁琼脂(5%Malt extract agar)、玉米粉琼脂培养基(Corn meal agar)、PDA培养基(Potato-dextrose agar)、YCB琼脂培养基(Yeast Carbon Base agar)、水琼脂培养基(Water agar)、YM琼脂(Yeast extract malt agar)、YM-2%NaCl琼脂(YM-2% sodium chloride agar)、酵母提取物-2%葡萄糖琼脂(Yeast extract-2% glucose agar)和酵母浸出物琼脂(Yeast infusion agar)等。20~25℃培养2~3d开始观察,在无菌条件下利用培养物的细胞制备水浸片或热固定染色片在显微镜下面观察有无有性孢子形成及有性孢子种类,是子囊孢子、担孢子还是冬孢子。未见有性孢子的应继续培养4~6周,然后每周观察一下是否生成有性孢子。
培养基配方:
醋酸盐琼脂培养基I:0.5%三水乙酸钠,pH6.5~7.0,2%琼脂,128℃湿热灭菌15min。
醋酸盐琼脂培养基II:在蒸馏水中加入0.1%(w/v)葡萄糖,0.18% KCl,0.25%酵母提取物,0.82%三水乙酸钠,1.5%琼脂,128℃湿热灭菌15min。
5%麦芽汁琼脂:5%麦芽汁提取物,2%琼脂,128℃湿热灭菌15min。
玉米粉琼脂培养基:见5.9
PDA培养基:在1L的马铃薯浸提液各添加20g葡萄糖和琼脂,128℃灭菌15min。马铃薯浸提液的制备:300g马铃薯去皮,切成小块,加水煮沸30min,滤去马铃薯块。将滤液补足至1L。或使用Bacto PDA(Difco)代替。
YCB琼脂培养基:取11.7g酵母碳源基础培养基,加入1000mL蒸馏水,2%琼脂,121℃湿热灭菌15min。
水琼脂培养基:将20g琼脂溶解于1L去离子水中,121℃湿热灭菌15min。
YM琼脂:见5.1
YM-2%NaCl琼脂:在1L YM琼脂培养基中加入20g NaCl即可。
酵母提取物-2%葡萄糖琼脂:溶解5g酵母提取物、20g葡萄糖和20g琼脂于1L去离子水中,121℃湿热灭菌15min。
酵母浸出物琼脂:溶解5g粉末状酵母提取物和15g琼脂于1L去离子水中,121℃湿热灭菌15min。
5.13 子囊孢子的数量
应描述有性繁殖方式为产子囊孢子的酵母菌菌种的每个子囊内含有的子囊孢子的数量,单位为“个/子囊”。
5.14 子囊孢子形状
应描述酵母菌菌种进行有性繁殖所产子囊孢子的形状,为球形、卵圆形、圆锥形、肾形、礼帽形、土星形、针形、纺锤形、棒状或其他形状。
6 生理生化实验
6.1 糖发酵实验
酵母菌菌种对糖的发酵实验采用杜氏管(Durham tube)法。
常规鉴定需要测试7种糖,包括:葡萄糖(glucose)、半乳糖(galactose)、蔗糖(sucrose)、麦芽糖(maltose)、乳糖(lactose)、棉子糖(raffinose)和海藻糖(trehalose),所用化合物均为进口试剂或国产分析纯。先将这7种糖用蒸馏水制成20%(w/v)(棉子糖为40%)的母液,过滤灭菌后放在4℃冰箱备用。
用蒸馏水配制0.5%(w/v)的酵母提取物(Yeast Extract)溶液,取3.6mL分装于口径为12mm的试管中,放入倒置的发酵管,用棉塞封口后116℃灭菌30min,然后每个试管内加入0.4mL糖母液,备用。
将酵母菌菌种划线接种于麦芽汁琼脂培养基上,25℃培养2~3d进行活化,再转接于麦芽汁液体培养基中,于25℃培养24~48h,制成细胞悬浮液。以每试管0.1mL的量接种于准备好的发酵试管内,摇匀,25℃下培养两周,期间观察杜氏管内是否有气体积存及其积存量,第一周内每天记录一次,第二周内每2~3d记录一次,最后结果以下述符号表示:
+ 强发酵,7d内气体迅速充满倒置管
L 延迟发酵,7d后倒置管才迅速充满气体
W 弱发酵,倒置管内有气体,但直到最后也未充满
- 不发酵,倒置管内无气体积存
V 同一种内有的菌株发酵,有的不发酵或弱发酵
6.2 碳源同化实验
常规鉴定选用34种碳源化合物作为同化试验对象,若该酵母菌为模式菌株,则应选用47种碳源化合物作为同化试验对象(见《酵母菌菌种资源数据标准》中“酵母碳源利用库数据标准”),所用化合物均为进口试剂或国产分析纯。常规鉴定所用碳源化合物包括:
六碳糖:D-葡萄糖(D-glucose)、D-半乳糖(D-galactose)、L-山梨糖(L-sorbose);
五碳糖:D-木糖(D-xylose)、L-阿拉伯糖(L-arabinose)、D-阿拉伯糖(D-arabinose)、D-核糖(D-ribose)、L-鼠李糖(L-rhamnose);
双糖:蔗糖(sucrose)、麦芽糖(maltose)、纤维二糖(cellobiose)、海藻糖(trehalose)、乳糖(lactose)、蜜二糖(melibiose);
三糖:棉子糖(raffinose)、松三糖(melezitose);
多糖:可溶性淀粉(soluble starch);
醇类:赤藓糖醇(erythritol)、核糖醇(ribitol)、D-甘露醇(D-mannitol)、肌醇(inositol)、甘油(glycerol)、半乳糖醇(galactitol)、D-山梨醇(D-glucitol or sorbitol)、乙醇(ethanol);
有机酸:琥珀酸(succinic acid)、柠檬酸(citric acid)、DL-乳酸(DL-lactic acid);
糖苷:杨梅苷(salicin)。
首先,把各种碳源分别配成10倍葡萄浓度的同化母液,具体方法为:称取6.7g酵母含氮基础培养基(Yeast Nitrogen Base),加入与5g葡萄糖相当的碳源化合物(即与5g葡萄糖含有等当量的碳),棉子糖浓度加倍,溶于100mL去离子水中,若是有机酸先把酸度调至pH5.7,过滤灭菌后放入4℃冰箱作为同化母液备用。
第二步,在12mm口径试管中每管加入3.6mL蒸馏水,128℃灭菌30min后加入0.4mL同化母液制成同化管备用。
最后,把培养了24~48h的菌株用无菌水或氮源基础液体培养基制成细胞悬浮液,调整细胞浓度使悬液至半透光(A640≈1.0),然后用无菌吸管将悬浮液滴入准备好的同化管内,或用移液器吸入40~50μL,25℃下静置培养1周,2周,和4周分别记录结果。
同化结果的观察与记录方法:取一片白色卡片,其上用墨汁或黑色墨水划上约3/4mm宽的直线,把培养一段时间后的同化管充分摇匀,贴于该卡片上,透过培养液观察卡片上的黑线,并根据下述原则记录:
+++ 透过试管完全看不见黑线
++ 可见黑线但呈一发散的模糊线条
+ 黑线可见但边缘模糊
- 黑线清晰可见且边缘不模糊
同化结果按以下记录:
+ 强同化,两周内为++或+++
L 延滞同化,两周后迅速变为++或+++
S 缓慢同化,两周后缓慢变为++或+++
W 弱同化,记录为+
- 不同化
(+) 少数情况可以同化
V 有些菌株同化反应为+,有些菌株同化反应为-
+/W 可以同化或弱同化,所有菌株都可以生长,有些生长较弱
W/- 弱同化或不同化
6.3 氮源同化实验
酵母菌菌种对硝酸盐(nitrate)、亚硝酸盐(nitrite)、盐酸乙胺(ethylamine.HCl)、二盐酸尸胺(cadaverine.2HCl)、L-赖氨酸(L-lysine)、肌酸(creatine)和肌酸酐(creatinine)等的同化利用最有分类价值,日常鉴定中只需测硝酸盐的同化反应,在疑难情况下或新种鉴定时才需测其他氮源化合物的同化反应。由于有些氮源化合物被酵母菌同化分解后的中间产物对酵母自身的生长有抑制作用,因而在液体法测试中常出现假阴性反应,故氮源的同化反应常用固体生长谱法测试,方法如下:
先将测试酵母菌进行饥饿培养:把活化好的菌株接种在4mL无氮碳源基础培养基(Yeast Carbon Base)中,17~20℃培养5~7d,以消耗细胞内多余的氮源,防止出现假阳性结果。
制备碳源基础培养基平板:取11.7g酵母碳基础培养基,20g纯化琼脂粉,加1000mL蒸馏水,加热将琼脂粉溶化116℃灭菌30min,冷却至大约45℃时倒入预先加入1mL饥饿培养后的酵母细胞悬液的平皿中,混匀后静置,凝固后放在17~20℃培养箱内数小时使平板表面干燥,然后把少量所测氮源化合物点在平板上,若是亚硝酸钠或盐酸乙铵,则用接种针尖蘸取二者的溶解液,再点在平板表面上以避免浓度过量而抑制酵母细胞生长,通常一个平皿用两条交互垂直的直径线分为四部分,一部分点入硫酸铵作为阳性对照,一部分留作空白作为阳性对照,另外两部分点入所测试剂。置入试剂后的平皿在17~20℃下培养2~3d后观察记录结果。阳性反应者在所点试剂处或周围有酵母菌落生长。
6.4 无维生素培养基生长状况
在12mm口径试管中加入4.0mL无维生素酵母基础培养基,121℃湿热灭菌15min。接种方法:挑取一环培养了24~48h的酵母菌株,接种于一管无维生素液体培养基中,25℃震荡培养2~3d,将细胞内所携带的外源维生素消耗干净,再接一滴(约0.2mL)此菌悬液于第二支无维生素液体培养基中,于25℃培养3~7天后记录,记录方法与6.2相同。
无维生素酵母菌基础培养基:取5g硫酸铵,10g葡萄糖,10mg组氨酸盐酸盐,20mg甲硫氨酸,20mg色氨酸,500mg硼酸,40 mg硫酸铜,100 mg碘化钾,200 mg三氯化铁,400 mg硫酸锰,200 mg钼酸钠,400 mg硫酸锌,0.85g磷酸二氢钾,0.15g磷酸氢二钾,0.5g硫酸镁,0.1g氯化钠和0.1g氯化钙,加去离子水补足至1L。
6.5 依赖维生素特性试验
先按照6.10制备无维生素培养基液,用依次缺乏下列每一种维生素来制备一系列试管,每升培养液中所加的每种维生素的量如下:
对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid) 200μg
生物素(Biotin) 20 μg
叶酸(Folic acid) 2 μg
肌醇(myo-inositol) 10mg
烟酸(Nicotinic acid) 400 μg
泛酸钙(Pantothenate (Ca)) 2mg
盐酸吡哆醇(Pyridoxine HCl) 400μg
核黄素(Riboflavin) 200μg
盐酸硫胺素(Thiamin HCl) 400μg
接种方法、培养条件及结果记录与6.4相同。
6.6 类淀粉化合物的形成
选取6.2中培养四周后在含糖类或多元醇类化合物的同化管中呈阳性反应的试管,每管滴入1~2滴Lugol碘液,摇匀,呈蓝、紫或绿色者为阳性,表明有类淀粉类物质产生,否则为阴性。
Lugol碘液的制备:把1.0g碘,2.0g碘化钾溶于300mL蒸馏水中备用。
6.7 分解脂肪实验
将牛脂或猪油溶化后,取0.5mL注入热的无菌培养皿中,使成一均匀的薄层,放入4℃冰箱冷却2h。然后取果罗德科瓦培养基(葡萄糖 0.1%,蛋白胨1%,NaCl 12%,纯化琼脂2%,蒸馏水配制,115℃灭菌20min)15~20mL,溶化后冷却到45℃后,缓慢倒在油层上,待凝固后划线接种,28℃下培养数天后观察。若在划线处呈现不透明的脂肪酸钙白垩状沉淀,表明该酵母菌菌株可分解脂肪,结果为阳性,否则为阴性。
6.8 产酯实验
挑取一环培养了24~48h的酵母菌菌体接种到装有20mL产酯培养基(葡萄糖5g,10%豆芽汁100mL,分装于50mL三角瓶中,每瓶20mL,115℃灭菌20min)的50mL三角瓶中,25~28℃培养3~5d,用嗅觉检查酯类的形成与否,如有酯香味,则结果为阳性,否则为阴性。
6.9 产酸实验
将培养了24~48h的酵母菌菌体划线接种于生酸培养基(葡萄糖5g,灭菌的CaCO30.5g,酵母浸出液100mL,琼脂2g,间歇常压灭菌)平板上,28℃培养10d,采用目测法观察菌落周围是否有透明圈形成,如有透明圈形成,则结果为阳性,否则为阴性。
6.10 明胶液化实验
将培养了24~48h的酵母菌菌体穿刺接种于明胶培养基(5波美度麦芽法100mL,加明胶12g,加热使之溶解,分装试管,115℃灭菌20min,凝固后备用)中,于25℃培养1~3周,观察培养基有无被液化,如果被液化,则结果为阳性,否则为阴性。
6.11 尿素分解实验
6.11.1 固体法
把培养了24~48h的酵母菌菌体接种于Christensen尿素琼脂上,25℃培养5d,其间每天观察一次,出现深粉红色者为阳性反应。
Christensen尿素琼脂的制备:取1克蛋白胨,1克葡萄糖,5克氯化钠,2克磷酸二氢钾和0.012克酚红,溶于1升蒸馏水中,调pH值为6.8,再加入20克琼脂,加热熔化后分装试管,每只试管中分装4.5 mL,0.055MPa/30min灭菌后,每只试管中加入0.5 mL过滤灭菌的20%尿素,混匀,做成斜面备用。
6.11.2 液体法
把培养了24~48h的酵母菌菌体一环接种于无菌水稀释过的Difco Urea Broth尿素液体培养基中,25℃培养0.5~2d,每小时观察一次,出现深粉红色者为阳性反应。
6.12 高渗透压生长试验
将培养了24~48h的酵母菌菌体接种到含50%(W/V)葡萄糖的琼脂斜面上,25℃培养7~14d,其间每周观察一次。
50%葡萄糖琼脂斜面的制备:在500mL 1%的酵母浸出粉中先溶解20g琼脂,再加入500g的葡萄糖,定容到1000mL,分装到试管中,110℃灭菌10min,做成斜面备用。斜面变棕色的要舍弃。
6.13 抗放线菌酮实验
10倍母液的制备:溶解0.1g或1g抗放线菌酮于2.5mL丙酮中,将丙酮溶液加入100mL含6.7g酵母氮源基础培养基和10g葡萄糖的蒸馏水溶液中,充分混合后过滤除菌。
在12mm口径试管中每管加入3.6mL蒸馏水,121℃灭菌30min,加入0.4mL放线菌酮母液,使其最终浓度为0.01%和0.1%,接种方法,培养条件及结果记录与6.2相同,培养时最好在摇床上振荡培养。
6.14 1%乙酸培养基中生长实验
将培养了24~48h的酵母菌菌体点接或划线接种到含1%乙酸的培养基上,25℃培养3~6d观察菌落是否生长。
1%乙酸培养基的配制:将10.0g葡萄糖,1.0g胰蛋白胨和1.0g酵母粉溶解于100 mL蒸馏水中, 加2.0g琼脂混匀,121℃灭菌15min。冷却到45~50℃时加入1.0 mL冰醋酸,迅速摇匀倒平板。
6.15 温度实验
将培养了24~48h的酵母菌菌体接种到YM固体培养基上,分别在17~40℃的温度下培养5d,观察在各个温度下生长情况,把生长最缓慢的温度定为最高生长温度。
6.16 熊果苷裂解实验
熊果苷琼脂培养基配制:熊果苷0.5%,酵母粉0.5%,琼脂2%,0.103MPa灭菌30min。灭菌后立即加入无菌1%柠檬酸铁铵(每10mL培养基3~5滴),然后倒平板备用。
把培养了24~48h的酵母菌菌株划线接入熊果苷琼脂平板上,25℃培养,若2~5d内培养基中有深褐色色素出现,则结果为阳性。
6.17 DBB试验实验
把培养了24~48h的酵母菌菌株菌种接种于碳基础-尿素琼脂上25℃培养5~7d,然后55℃培养过夜,再冷却到室温,加入1~2滴新配制的冷的DBB反应液,室温下1~2min后出现深红色到紫红色者为阳性。
碳基础-尿素培养基的制备:将11.7g碳基础培养基,0.2g Fuchsin酸,20g琼脂溶于900mL无菌水中,0.103MPa灭菌15min,将100mL过滤灭菌的20%尿素加到溶解的培养基中,混匀,做斜面或倒平板备用。
DBB反应液的制备:将15mg DBB盐(o-dianisidine tetrazotized, Practical Grade,Sigma)溶于15mL冰浴过的0.25M Tris-HCl(pH7.0)缓冲液中,放在冰浴中30min内使用。
7 遗传学信息
本章实验所采取方法均为推荐使用方法。
7.1 G+C mol%
7.1.1 酵母总DNA的提取
将培养了24h的酵母菌菌种接入装有2mL YPD(葡萄糖1%,蛋白胨2%,酵母膏2%)培养基的试管,28℃摇床培养8h;转入装有30mL YPD培养基的三角瓶中,28℃摇床培养16h;用TE溶液(50mM Tris,50mM EDTA,pH8.0)洗涤菌体2次;悬浮于5mL TE溶液中,加几滴b-巯基乙醇,室温保持15min;3000rpm 离心15min,用SPS溶液(0.1M柠檬酸缓冲液,0.1M EDTA,1M山梨酸醇,pH5.8)洗涤1次;将细胞悬浮于20mL蜗牛酶溶液(100mg/mL,SE溶液溶解,即0.15M NaCl,0.1M EDTA,pH8.0),同时加入1mL 20%SDS溶液,37℃保温2h;加入2.4mL 5M NaClO4溶液,冰浴30min,出现沉淀后10000rpm离心20min;取上清液加入等体积氯仿—异戊醇(24:1)溶液脱蛋白,冰浴5min,3000rpm离心20min,重复3次;加95%冷乙醇沉淀DNA,用乙醇及丙酮淋洗两次,空干,溶于TE溶液中;加0.2% RNase溶液(0.15M NaCl,pH5.0)使终浓度为100mg/ml,37℃温育2小时;再加入等体积氯仿—异戊醇(24:1)溶液脱蛋白,最后用冰冷的异丙醇及丙酮淋洗两次,溶于1×SSC溶液(0.15M NaCl,0.015M柠檬酸三钠,pH8.0)中,4℃保存备用。
7.1.2 G+C mol%的测定
1 将DNA样品用0.1×SSC溶液稀释至OD260nm值于0.3~0.6间,使用可调温紫外分光光度计仪器测定Tm值;
2 在波长260nm处记录25℃的吸光度值,然后温度迅速上升至50℃;
3 OD值开始上升表示变性开始,每隔1℃记录杯内温度和OD值,直至OD值不变;
4 OD值乘相应温度的相对膨胀系数(Vt)与25℃时OD相比Vt/V25求得相对光密度;
5 以T为横坐标,以相对OD为纵坐标,绘制热变性曲线,曲线中点相对应的T即为熔链温度(Tm值)。按照以下公式计算,对照菌株为E. coli K12。
G+C mol%=(Tm-Tm E.coli)×2.08+51.2
7.2 核酸序列信息
7.2.1 总DNA提取
用接种环自新活化的所测菌株的麦芽汁斜面上挑取少量菌体(一环),置于一已灭菌的1.5mL的离心管内;加入100μL裂解液(100mM Tris, 30mM EDTA, 0.5% SDS, pH 8.0, 15P灭菌30min备用),100℃水浴15min;加入100μL 2.5M的醋酸钾后,置于冰上30min至1h;在4℃下13000rpm离心5min,上清夜移至一新1.5 mL离心管内;加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1),剧烈振荡后,13000 rpm,离心15min,移取上清夜至另一灭菌的1.5mL的离心管内;重复上一步,直到两相之间没有沉淀,将上清液移至另一灭菌的0.5mL的离心管内;加入等体积的冷的异丙醇,放置在-20℃静置15min;13000 rpm离心15min,然后用100μL 70%的乙醇洗涤沉淀2次;将沉淀置于真空干燥器中抽干,加入50μL已灭菌的Milli-Q水,在4℃下溶解2h,放于-20℃冷藏备用。
7.2.2 PCR扩增
1 PCR反应液的组成(50μL)
KCl 50 mM;MgCl2 2 mM;Tris-HCl (pH 9.0) 10mM;引物P1 0.6 µM;
引物P2 0.6 µM;DNA模板 10 ng-1µg;Taq酶 1U;
2 PCR反应循环参数
95℃ 5min;94℃ 1min,52℃ 1min,72℃ 1分20sec,循环36次;72℃ 8min;4℃ ∞。
3 PCR反应和测序反应所需引物
26S rDNA D1/D2区引物
NL1:5’ – GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG– 3’
NL4:5’ – GGT CCG TGT TTC AAG ACG G– 3’
ITS区引物
ITS1:5’ – GTC GTA ACA AGG TTT CCG TAG GTG – 3’
ITS4:5’ – TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC – 3’
18S rDNA引物
P1F:5’ – ATC TGG TTG ATC CTG CCA GT – 3’
U3R:5’ – GAC GGG CGG TGT GTA CAA AGG GCA G – 3’
7.2.3 序列测定
将所得PCR扩增原液送交专门的测序公司进行纯化和序列测定,用DNA Star和BioEdit等软件并结合DNA正反向序列图谱对DNA序列进行手工校正。
7.3 营养缺陷型
指酵母菌菌种经诱变筛选后所失去的对某种营养元素的合成能力,缺陷类型可以为氨基酸、生物素等。
7.4 携带特定用途的基因元器件名称
指酵母菌菌种资源本身所携带的具有某些特定用途的质粒、F因子、载体、筛选标记基因、启动子、增强子、信号肽基因等基因元器件的名称。
7.5 核型信息
7.5.1 完整的酵母菌染色体DNA样品的制备
将培养了24~48h的菌株接种于5mLYM培养基中,25℃下摇床培养20~24h;离心收集菌体,并用50mM EDTA(pH8.0)洗2次,加100µL SPG缓冲液(10mM NaH2PO4,50%甘油,pH6.2)制成悬浮液;取加100µL细胞悬浮液与50µL溶于SPG缓冲液的裂解酶混合,37℃下保温5~10min破壁;加入350μL冷却至42℃的用125mM EDTA(pH8.0)配制的1%低溶点琼脂糖,混和后注模(20mm×9mm×1.2mm),4℃下凝固30min;胶块放入2mL LET(500mM EDTA,10mM Tris,pH8.5)缓冲液中,加入150μL b-巯基乙醇,37℃保温24h;弃LET缓冲液,胶块用50mM EDTA(pH8.0)洗3次后加入2mL含蛋白酶K(0.5mg/mL)的NDS(10mM Tris,500mMEDTA,pH8.0,0.1%Lauroylsarcosine Na)缓冲液,50℃保温24h;弃NDS缓冲液,胶块用50mM EDTA(pH8.0)洗3次后放入100mM EDTA,10mM Tris,pH9.0缓冲液中,4℃下保存备用。
7.5.2 脉冲电泳
用脉冲电场凝胶电泳仪进行电泳,琼脂糖浓度为0.8~1%,电泳缓冲液为0.5×TBE。电泳程序依不同的属、种而设置,电泳液温度维持在12~14℃。电泳后胶块在EB水溶液(0.5mg/L)中染色0.5~1h,然后在蒸馏水中浸泡进行背景脱色,在302nm紫外灯下观察并照相,根据染色体DNA的分子量标准初步计算每条染色体的大小。
7.6 辅酶Q类型
7.6.1方法一:
1、菌种培养和辅酶Q的提取
将酵母菌培养于葡萄糖/蛋白胨/酵母提取物培养基(2/0.4/0.3%, w/v, 500mL)中,摇床培养24~72h(Yamada和Kondo 1973,Yamada等人1989c)。离心收集菌体并悬浮于150mL水/乙醇(1:2,v/v)中,包含20g NaOH和5g 焦性没食子酸。于95℃水浴(或加热炉)中保温30min来水解酵母细胞。在水笼头下冷却25min后,加入100mL正己烷剧烈摇晃,然后3000rpm离心2min,辅酶Q就被提取出来了。倒出来的正己烷提取物加入30mL水摇晃,再用分液漏斗移去水分,如此反复3次除去NaOH。负压下蒸干后,将残留物用30mL丙酮处理。将黄色的丙酮溶液真空浓缩至1mL。
2、辅酶Q的纯化
用准备好的薄层层析(于20×20mm的平板玻璃上制备0.5mm的硅胶60F254层)来纯化辅酶Q,苯作展开剂。一条黄色的带(Rf 0.3~0.5),与此相对应的一个黄色的参考标准物的点(Q-6和/或Q-10),也可在短波紫外光(254nm波长)下看到一个黑色的带,将这条带刮擦下来。将黄色的硅胶粉末转移至漏斗的滤纸上,用2mL的丙酮抽提此黄色物质。将黄色溶液真空浓缩至150µL。这种类异戊二烯醌在-20℃条件下在乙醇中可以产生结晶。
3、辅酶Q族化合物的鉴定
(1) 反向纸层析:将浸满3.0%硅油(w/w, KF-54,Shin’etsu Chem. Co)的小滤纸条(12×40cm, Whatman No.1或Toyo No. 50)浸渍于氯仿中(Yamada和Kondo 1973,Yamada等人1989c)。将待测样品点在纸条的一端,已知标准对照样品(Q-6到Q-10)点于待测样品两边。将纸条用己醇/己酸乙酯/水(5:3:1,v/v/v)展开。同时,另外浸满2.5%白凡士林的滤纸条(w/w,U.S. Pharm)浸渍于甲苯中。在后者中,溶剂系统用的是N,N-二甲基甲酰胺/水(97:3, v/v)。样品展开和干燥后,用0.3%KMnO4水溶液(w/v)氧化,就可以看到位于层析图上黄褐色的点。纸上残留的KMnO4在水笼头下用水洗净。
(2) 反向薄层层析法:将样品点在一个反向薄层板(HPLC RP-18F254S,10×10cm,0.2mm,E. Merck),然后用丙酮/乙腈(4:1,v/v)(Collins和Jones 1981)。辅酶Q族化合物的点在短波紫外光(254nm波长)下可以看见,或用50%H2SO4(v/v)喷后再在加热箱中120~150℃加热2~5min后就可看见。
(3) 高效液相色谱法:在Novapak C18柱(3.9×150mm,Waters)上分离辅酶Q族化合物。别的可用的柱子有:Zorbax ODS(4.6×150mm,Du Pont);Cosmosil 5C18柱(4.6×150mm,Nacalai);? Bondapak C18柱(3.9×300mm,Waters)。流动相为甲醇/异丙醇(7:3和/或1:1,v/v),流动速率为1.0mL/min(或1.5~2.0mL/min)。在275nm下监测。将待测样品峰与已知标准(Q-6到Q-10)相比较。
7.6.2 方法二
1、将活化好的所要测试的菌株接种于300mL已灭菌YM液体培养基中中,17℃,180rpm下震荡24h或更长,视菌体生长的不同速度而定;5000rpm离心5min收集菌体,用蒸馏水洗两次;将菌体移入100mL圆底烧瓶内,加入0.7g焦性没食子酸(Pyrogallol)、2.5g KOH、19mL甲醇、7mL蒸馏水,混匀,90℃回流1h;在自来水下迅速冷却至室温后,加入40mL正己烷,剧烈震荡5min后,离心(5000rpm,5min)亦可静置分层;移取上清液至一碘量瓶内,加入20mL水,剧烈震荡后静置分层,将上清液移入烧杯内,置入通风橱中自然蒸发,约12 h正己烷即可完全蒸发;将残留物溶于0.5~1mL丙酮中,即得辅酶Q粗提物。
2、辅酶Q的纯化
将所有辅酶Q粗提物涂布于活化好的层析硅胶板(GF254,20×20cm)的底线上,在一侧点上标准辅酶Q,以苯作为液相层析约30~40min;取出硅胶版在通风橱内完全干燥,刮取底线上方与标准辅酶Q样点一样平齐的一条黄色层析带,移至离心管内,加入1.0丙酮振荡抽提,离心(5000rpm,5min)将上清液移至一新的离心管内,开盖在通风橱或实验室内让丙酮挥发(至30~50μL)以浓缩辅酶Q。
3、辅酶Q类型的测定
将适量医用白凡士林溶于石油醚中制备5.0%(W/V)凡士林液,将滤纸(12×12cm)浸入凡士林液内,浸透后取出自然干燥,制成反相层析纸;在反相层析纸上点少量纯化后的辅酶Q及其标样,用量以样点呈肉眼明显可见的黄色为准,以N,N-二甲酰胺-水(97:3)为液相层析约2.5h。将所测样品的比移值(Rf)与标样比较即可确定其辅酶Q类型。若层析后样点太弱,可在短波紫外灯(254nm)下显色。
8 其它
8.1 主要用途分类
指酵母菌菌种资源的主要用途,分为:分类;研究;教学;分析检测;生产;其它。
8.2 具体用途
指酵母菌菌种资源的具体用途,如用于酿造葡萄酒等。
8.3主要代谢产物名称
指酵母菌菌种资源以何种底物发酵而产生的主要代谢产物名称,如以葡萄糖为底物发酵产生乙醇等。
8.4致病对象
指酵母菌菌种资源的致病对象类别,如人类等。
8.5致病名称
指酵母菌菌种资源的具体导致病变的名称,如皮肤感染等。
8.6 图像信息
8.6.1 与酵母菌菌种资源有关的菌落、细胞、孢子、菌丝等图片信息。
8.6.2 酵母菌菌种资源本身所携带的具有特定用途的基因元器件结构图。
8.7 文献信息
已在正式刊物上发表的与该株酵母菌菌种有关的文献资料信息,具体写法参照GB 7714-1987。
8.8 数据源主键
连接微生物菌种资源特性数据的主键值,以菌种保藏编号(无空格)表示。
9
附录I:
代码 |
省市名称 |
代码 |
省市名称 |
11 |
北京市 |
44 |
广东省 |
12 |
天津市 |
45 |
广西壮族自治区 |
13 |
河北省 |
46 |
海南省 |
14 |
山西省 |
50 |
重庆市 |
15 |
内蒙古自治区 |
51 |
四川省 |
21 |
辽宁省 |
52 |
贵州省 |
22 |
吉林省 |
53 |
云南省 |
23 |
黑龙江省 |
54 |
西藏自治区 |
31 |
上海市 |
61 |
陕西省 |
32 |
江苏省 |
62 |
甘肃省 |
33 |
浙江省 |
63 |
青海省 |
34 |
安徽省 |
64 |
宁夏回族自治区 |
35 |
福建省 |
65 |
新疆维吾尔族自治区 |
36 |
江西省 |
71 |
台湾省 |
37 |
山东省 |
81 |
香港特别行政区 |
41 |
河南省 |
82 |
澳门特别行政区 |
42 |
湖北省 |
99 |
不详 |
43 |
湖南省 |
|
|
参考文献
[1] Cletus P. Kurtzman, Jack W. Fell. The Yeasts, a Taxonomic Study (4th edition) [M]. 1998
[2] N.J.W Kreger-van Rij. The Yeasts, a Taxonomic Study (3th edition) [M]. 1984
[3] J. A. BARNETT, R. W. PAYNE, D. YARROW. Yeasts: Characteristics and Identification (3rd edition) [M] .2000
[4] J. A. BARNETT, R. W. PAYNE, D. YARROW. Yeasts: Characteristics and Identification (1st edition) [M] 1983
[5] P.M. Kirk,P.F. Cannon,J.C. David,J. A. Stalpers. Dictionary of the Fungi (9th edition) [M]. 2001
[6] H.J.法夫等. 酵母菌的生活[M]. 王民俊等译. 贵阳:《酿酒科技》编辑部,1984
[7] J.A.巴尼特,R.W.佩恩,D.亚罗. 酵母菌的特征与鉴定手册[M]. 胡瑞卿译. 青岛:青岛海洋大学出版社,1991
[8] 曹一化,刘旭等。自然科技资源共性描述规范[M]. 北京:中国科学技术出版社,2005
[9] 杜连祥. 工业微生物学实验技术. 天津: 天津科学技术出版社,1992