酵母菌菌种资源图像采集技术规程

起草单位：中国食品发酵工业研究院

前  言

本规程由微生物菌种资源平台建设项目提出。

本规程起草单位：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国兽医药品监察所、中国食品发酵工业研究院。

主要起草人：程池、李金霞、姜瑞波、周宇光、朴春根、叶强、张月琴、陈敏等。

 

引言

酵母菌是一类重要的微生物资源，广泛应用于各种酿酒、酱油、制醋、单细胞蛋白、焙烤、石油脱蜡、甘油、维生素、酶制剂、生物制药和基因工程等领域，是微生物学研究及生物技术产业持续发展的重要基础，也是微生物多样性的重要组成部分。

酵母菌菌种资源的图像资料对于酵母菌的分类、研究等具有重要作用，为规范酵母菌图像采集流程，避免因采集的图像不规范给酵母菌分类和科研工作带来误差，特制定《酵母菌菌种图像采集技术规程》，以确保酵母菌菌种图像采集的科学性。

本技术规程提供了酵母菌菌种资源图像采集的方法和要求，重在规范酵母菌菌种图像采集的流程，对从事酵母菌菌种基础研究的工作人员提供了系统且具操作性的指导。

主要内容分为酵母菌菌落图片的采集、酵母菌细胞图片的采集、酵母菌丝图片的采集、酵母菌有性孢子图片的采集、酵母菌无性孢子图片的采集和酵母菌电镜图片的采集，对每种采集方法所使用的实验材料和具体操作流程都进行了规范。

在编写过程中，尽可能收集了国内外各方面的资料，借鉴其中有益的经验，也有不少编写者实际工作中积累的经验，初步形成了该技术规程的征求意见稿。

 

 

目    次

前  言... 197

引言... 198

目    次... 199

酵母菌菌种资源图像采集技术规程... 200

附录I 208

附录II 209

附录III 211

参考文献：... 212

 

 

酵母菌菌种资源图像采集技术规程

1  范围

本规程规定了酵母菌菌种图像采集的技术和程序。

本规程适用于酵母菌菌种图像的采集工作。

2　术语和定义

下列术语和定义适用于本规程

2.1 芽殖 budding

即出芽繁殖，指在酵母菌细胞在无性繁殖过程中产生芽细胞，形成小芽，并增大形成子细胞，随后脱离母细胞而形成新的细胞。

2.2 裂殖 fission

指酵母菌细胞在其长轴中部细胞壁向内生长形成隔膜，在隔膜处横向裂开形成两个细胞。

2.3 假菌丝 pseudohypha

指酵母菌菌种进行一连串的芽殖后，长大的子细胞仍不脱落分离，细胞成串排列，形成类菌丝状，在分隔处缢缩。

2.4 真菌丝 true hypha

指菌丝顶端连续生长产生隔膜形成的菌丝称为真菌丝，隔膜处不缢缩。

2.5 子囊孢子 ascospore

是指子囊酵母在有性繁殖过程中形成含有被称之为游离细胞的单倍体有性孢子的结构， 其中单倍体有性孢子叫做子囊孢子,孢子壁多层，由外部孢周壁、中间层和孢子外壁组成，有时有内生孢子内壁。

2.6 担孢子 basidiospore

    在一个担子上经减数分裂后产生的包含一个或两个单倍体细胞核的繁殖细胞，通常生在称为小梗的一端尖细的特殊结构上。

2.7 冬孢子 teliospore

黑粉菌目和锈菌类的种产生的一种间生或端生于双核菌丝体上的厚壁结构，在其中发生核配，上面能长出担子。

2.8 芽生孢子 blastospore

指假菌丝上通过出芽形成的无性繁殖细胞，通常靠近长细胞的一端，或长在假菌丝细胞连在一起处。

2.9 节孢子 arthrospore(亦可称为arthroconidium)

由无性真菌丝分节或单个细胞被隔膜分开或脱节而形成特殊的单核细胞称为节孢子，也称粉孢子。

2.10 厚垣孢子 chlamydospore

是指白假丝酵母(Candida albicans)和梅奇酵母属(Metschnikowia)中一些种在中间或顶端发生局部的细胞质浓缩和细胞壁加厚，最后形成的一些透明或棕色的厚壁单细胞无性休眠孢子。有时也在丝孢酵母属(Trichosporon)和隐球酵母属(Cryptococcus)的一些种中出现，在类酵母（Aureobasidium pullulans）也大量存在。

2.11 掷孢子 ballistospore(亦称为ballistoconidium)

是指由掷孢酵母科的某些属产生的一种特殊无性孢子，生长在无性细胞突出的小梗上，并通过特殊的形成小滴的方式将孢子从小梗上弹射出来。

2.12 内生孢子 endospore(亦称为endoconidium)

是指在某些酵母菌的离散的细胞和菌丝内形成的无性细胞，常见于在Trichosporon，Candida，Cryptococcus，Oosporidium，Cystofilobasidium和Leucosporidium属的一些种。与厚垣孢子和子囊孢子不同，内生孢子不能被选择性的染上色。

2.12　锁状联合 clamp connection

指菌丝在细胞分裂处长出的连接两个分裂细胞的弯曲的、有隔膜的桥式连接。这种结构保证了来自一个细胞的相对性别的双核能有规则地分配到下一个细胞中。

3        图像技术要求

1. 3.1              图片格式应为.jpg(jpeg)格式。
2. 3.2              图片像素为1024×768。
3. 3.3              图片文件名称为“平台资源号.jpg”，如同一份资源有多幅图片，则文件名称为“平台资源号-1.jpg”、“平台资源号-2.jpg”……。
4. 3.4              细胞、孢子等显微照片要有统一尺寸标识。
5. 3.5              主体图像要求清晰。
6. 3.6              菌种图片上除标识菌种编号或标尺外，均不能人为改动图片内容。

4        酵母菌菌落图片的采集

4.1              将酵母菌菌种划线接种于麦芽汁固体培养基上，25℃培养2～3天进行活化。

4.2              将活化好的菌株接种于新鲜的麦芽汁、YM或葡萄糖-蛋白胨-酵母提取物（YPD） 固体斜面或平板培养基上，培养基配制方法见附录I，接种方法如下：

——斜面接种方法为自下而上划直线。

——平板接种方法为在平板的一边（相当于表盘10点至2点的位置）划直线接种，在相对的另一边点接一点。

4.3              25℃条件下培养1～7天，通常培养2～3天进行图像采集，特殊菌种可在其要求的温度下培养。。

4.4              图像采集注意事项：

——图片背景应为深色，要求与试管或平板形成强烈对比反差；

——平皿或试管表面应于照像机镜头尽量保持平行，不能有超过15°角的偏差；

——拍摄时应尽量避免玻璃反光，如果是平板培养物，则应在镜头前加用偏光镜片以消除平皿盖上的反光。如无此条件，应将平皿盖打开后再进行图像采集；

——让试管或平板图像充满整个图片。

5        酵母菌细胞图片的采集

1. 5.1              将酵母菌菌种划线接种于麦芽汁固体培养基上，25℃培养2～3天进行活化。

5.2              挑取活化好的菌体1环接种于装有30mL液体培养基的塞有棉塞的100mL三角瓶中，也可用装有5mL培养基的直径为16mm的试管代替，25℃静置培养2～3天(A₆₄₀≈1.0)，特殊菌种可在其要求的温度下培养。常用液体培养基为：麦芽汁、YM或葡萄糖-蛋白胨-酵母提取物液体培养基中，配制方法见附录I。

1. 5.3              将培养液摇匀，取一片干净的载玻片，在载玻片中央滴加一滴菌悬液，将盖玻片斜置轻轻盖在液滴上。也可先在载玻片中央先滴加一小滴0.1%美蓝染色液，再进行上述操作。
2. 5.4              将样品置于400～600倍光学显微镜下观察，选取具有代表性的细胞形状和无性繁殖方式视野进行图像采集。

6        酵母菌菌丝图片的采集

1. 6.1              将酵母菌菌种划线接种于麦芽汁固体培养基上，25℃培养2～3天进行活化。
2. 6.2              制备玉米粉琼脂培养基，配制方法见附录II，室温下放置1～2天，使表面干燥。
3. 6.3              将活化好的菌种接种在玉米粉琼脂培养基上，接种方法为：在平板的一侧相当于表盘10点至2点的位置划直线接种，在中间盖上一片无菌盖玻片，在相对的另一边点接两点，在其中一点上放置无菌盖玻片。
4. 6.4              25℃条件下培养7～10天后，在显微镜低倍镜下直接观察菌丝形态并采集图像，无需制成载玻片。

7        酵母菌有性孢子图片的采集

7.1              子囊孢子

1. 7.1.1        将酵母菌菌种划线接种于麦芽汁固体培养基上，25℃培养1～2天进行活化。
2. 7.1.2        挑取少许菌体接种于产孢培养基上。产孢培养基有：醋酸盐琼脂培养基I(Acetate agar I)、醋酸盐琼脂培养基II(Acetate agar II)、5%麦芽汁琼脂(5%Malt extract agar)、玉米粉琼脂培养基(Corn meal agar)、PDA培养基(Potato-dextrose agar)、YCB琼脂培养基(Yeast Carbon Base agar)、水琼脂培养基(Water agar)、YM琼脂(Yeast extract malt agar)、YM-2%NaCl琼脂(YM-2% sodium chloride agar)、酵母提取物-2%葡萄糖琼脂(Yeast extract-2% glucose agar)和酵母浸出物琼脂(Yeast infusion agar)等。配制方法见附录II。可使用具塞试管或普通平板。
3. 7.1.3        20～25℃条件下培养2～3天，从培养物上无菌条件下制备水浸片或热固定染色片在显微镜下面观察有无子囊孢子形成。未见子囊孢子的应继续培养4～6周，然后每周观察一下是否生成子囊孢子。
4. 7.1.4        子囊孢子染色：将菌体涂片，热固定，用5%的孔雀绿溶液覆盖热固定后的载玻片，加热至有蒸汽，同时要注意补充覆盖液以防止蒸干，持续3～5分钟后用水冲冼30秒，然后用0.5%的番红溶液复染10秒。
5. 7.1.5        显微镜下观察并采集图像，子囊孢子应为绿色，营养细胞为红色。

7.2              冬孢子

1. 7.2.1        将担子纲酵母菌菌株接种于麦芽汁固体培养基上，25℃培养1～2天进行活化。

7.2.2        将活化好的菌种接种在玉米粉琼脂培养基上，接种方法为：将配对菌种在平板上交叉划线，17℃培养。

7.2.3        定期在无菌条件下挑取少量培养物，制备水浸片，在显微镜下观察菌丝、锁状联合及冬孢子的产生，并采集图像。

7.3              担孢子

1. 7.3.1        冬孢子的形成见7.2。
2. 7.3.2        17℃条件下继续培养8～10周，冬孢子开始萌发形成原菌丝，继而在原菌丝上产生单倍体的担孢子，在显微镜下观察并采集图像。

8        酵母菌无性孢子图片的采集

8.1              芽生孢子

    见“6 酵母菌菌丝图片的采集”，存在于产生假菌丝的酵母菌中。

8.2              节孢子

见“6 酵母菌菌丝图片的采集”，存在于无性繁殖方式为裂殖的酵母菌中。

也可采用以下方法观察：

1. 在培养皿内铺一张圆形滤纸片，上面放一U形玻棒，在U形玻棒上放1块载玻片及2块盖玻片，盖上培养皿盖，用纸包好，121℃灭菌30分钟，备用；
2. 将灭菌后的PDA培养基倒入无菌平皿内，凝固后备用；
3. 用无菌镊子取一小块备好的培养基于载玻片上，每张载玻片上时放2块培养基，然后用接种针挑取少量酵母菌菌种于培养基上，用镊子将培养皿内的盖玻片盖在琼脂块上，轻轻按压，使载玻片与盖玻片的距离相当接近；

4.        在培养皿中滴入少许20%的无菌甘油，使皿内的滤纸保持湿润，于28℃培养3天后观察并采集图像。

8.3              厚垣孢子

    见“5 酵母菌细胞图片的采集”，培养时间较细胞图片采集要长。

8.4              掷孢子

    掷孢子一般作为一个倒扣着的带盖平板所释放出来的孢子在盖上所形成的镜像影射。合适的培养基有：玉米粉琼脂培养基，麦芽汁琼脂培养基和YPD培养基。在一个含有10ml固体培养基的平板上按直径方向十字画线接种。将平板翻转扣在另一个含有培养基的平板上，在这个平板上放一个灭过菌的载玻片。其中一条划线位于载玻片的正上方，将这两个半拉平皿轻扣在一起。将培养物于18～20℃条件下培养。释放出来的孢子在底部的平板上形成菌落，有的被收集在玻璃载玻片上，这些可以拿来在显微镜下面观察。

8.5              内生孢子

    在Trichosporon, Candida, Cryptococcus, Oosporidium, Cystofilobasidium和Leucosporidium属的一些种中能够观察到。它们通常在一些常见培养基如YM琼脂，土豆汁琼脂和玉米肉汁培养基在室温下培养时能够观察到。

9        酵母菌电镜图片的采集

9.1 扫描电镜图片采集

9.1.1收集菌体：取液体或固体培养基中旺盛生长的酵母菌体。

(1) 液体培养基中的菌体，取适量培养液，8000rpm离心3～5min，弃上清，倒入2.5%戊二醛固定；

(2) 固体培养基上的菌体，可在菌落表面滴几滴戊二醛固定液，轻刮菌落，注意不要刮下培养基。将菌液吸入小离心管，离心后换入新鲜戊二醛固定；与固体培养基结合紧密的酵母菌，可在菌落四周用刀片划5×5mm见方小块。将小块挑出，片成2mm厚的薄片。投入装有戊二醛固定液的青霉素小瓶。(注意：因菌块易漂浮，用注射器从橡胶瓶塞刺入，抽出空气，使样块沉下，块状样品固定，脱水，干燥与组织块制样相同。)

9.1.2固定，脱水：

2.5%戊二醛固定2～4h→磷酸缓冲液清洗3次，15～20min/次→1%锇酸固定4～6h→缓冲液洗3次→乙醇系列脱水，30%，50%，70%，85%，95%各一次，100%乙醇2次，15～20min/次。(注意：菌悬液每步均需离心，8000rpm，3～5min，弃上清，倒入下一种试剂，滴管来回吸几下，打散菌块。)

9.1.3置换：乙酸异戊酯置换2次，20min/次。

9.1.4临界点干燥：普通定性滤纸裁成35×18mm的纸条，将长边35mm平均分成3份，对折成小纸包，用订书钉将一端订牢，成小口袋状。将离心浓缩后的菌液滴入小纸包，立即用订书机将另一端钉死。放入临界点干燥样品室，进行CO₂临界点干燥。（注意，需用液CO₂置换2～3次）。

9.1.5离子溅射金：沿两端书钉剪开滤纸包，将干燥后粉末状纯菌体倒入平皿，轻摇尽量分散菌体。碳导电胶带一面粘在1/4盖玻片上，另一面倒扣轻压在菌体粉末上，翻正后用镊子或牙签将菌体轻轻刮薄铺平；块状样品直接粘在样品台上。离子溅射金后，即可进行扫描电镜观察和图片采集。

9.2 透射电镜超薄切片图片采集

9.2.1收集菌体同9.1.1。

9.2.2固定，脱水同9.1.2。

9.2.3置换：环氧丙烷置换2次，20min/次。

9.2.4 浸透：环氧丙烷：E P O N 812树脂（1：1），浸透6h以上；纯树脂浸透过夜。

9.2.5 E P O N 812环氧树脂包埋，固化。

9.2.6超薄切片机切片（500～1000A）。

9.2.7乙酸双氧铀—柠檬酸铅双染色。

9.2.8透射电镜观察，采集图片。

 

 

附录I

1、麦芽汁培养基(Malt extract )：

将麦芽提取物稀释至10°波美度，115℃湿热灭菌15分钟。

2、麦芽汁固体培养基(Malt extract agar)：

10°波美度麦芽汁1L，20g琼脂，115℃湿热灭菌15分钟。

3、  YM培养基(Yeast extract malt extract broth)

    将3g酵母提取物、3g麦芽提取物、5g蛋白胨和10g葡萄糖溶解在1升水中,培养基的pH值因培养基成分的批次不同而在5～6之间浮动，121℃湿热灭菌15分钟。也可用市售的Bacto YM Broth(Difco)代替。

4、  YM固体培养基(Yeast extract malt extract agar)

Bacto YM agar（Difco）或在1L YM液体培养基的基础上添加20g琼脂，121℃湿热灭菌15min。

5、  葡萄糖-蛋白胨-酵母提取物培养基(Glucose-peptone-yeast extract broth)

    将20g葡萄糖、10g蛋白胨和5g酵母提取物溶于1L去离子水中。121℃湿热灭菌15分钟。

6、  葡萄糖-蛋白胨-酵母提取物固体培养基(Glucose-peptone-yeast extract agar)

在1L葡萄糖-蛋白胨-酵母提取物液体培养基的基础上添加20g琼脂，121℃湿热灭菌15min。

 

 

附录II

1、醋酸盐琼脂培养基I(Acetate agar I)

0.5%三水乙酸钠，pH6.5～7.0，2%琼脂，121℃湿热灭菌15分钟。

2、  醋酸盐琼脂培养基II(Acetate agar II)

在蒸馏水中加入0.1%(w/v)葡萄糖，0.18% KCl，0.25%酵母提取物，0.82%三水乙酸钠，1.5%琼脂，121℃湿热灭菌15分钟。

3、  5%麦芽汁琼脂(5%Malt extract agar)

5%麦芽汁提取物，2%琼脂，121℃湿热灭菌15分钟。

4、  玉米粉琼脂培养基(Corn meal agar)

将42g玉米粉加入1L去离子水中60℃加热1小时，用滤纸过滤再加水至1L。加入12g琼脂溶解。121℃湿热灭菌15分钟。或使用Bacto CMA（Difco）代替。

5、  PDA培养基(Potato-dextrose agar)

在1L 的马铃薯浸提液各添加20g葡萄糖和琼脂，128℃灭菌15min。马铃薯浸提液的制备：300g马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸30min，滤去马铃薯块。将滤液补足至1L。或使用Bacto PDA（Difco）代替。

6、  YCB琼脂培养基(Yeast Carbon Base agar)

　　取11.7g酵母碳源基础培养基，加入1000ml蒸馏水，2%琼脂，121℃湿热灭菌15分钟。

7、  水琼脂培养基(Water agar)

将20g琼脂溶解于1L去离子水中，121℃湿热灭菌15分钟。

8、  YM-2%NaCl琼脂(YM-2% sodium chloride agar)

在1L YM琼脂培养基中加入20g NaCl即可。

9、  酵母提取物-2%葡萄糖琼脂(Yeast extract-2% glucose agar)

溶解5g酵母提取物、20g葡萄糖和20g琼脂于1L去离子水中，121℃湿热灭菌15分钟。

10、            酵母浸出物琼脂(Yeast infusion agar)

溶解5g粉末状酵母提取物和15g琼脂于1L去离子水中，121℃湿热灭菌15分钟。

 

附录III

1、0.1%美蓝染色液

A液：美蓝(methylene blue，又名甲烯蓝)0.3g，95%乙醇30ml；

B液：KOH 0.01g，蒸馏水100ml。

混合A液和B液，按1：10稀释成0.1%美蓝染色液。

2、5%孔雀绿溶液

    孔雀绿5.0g，蒸馏水100ml。

3、0.5%番红溶液

番红O(safranine O，又称沙黄O)2.5g，95%乙醇100ml，溶解后贮存于密闭的棕色瓶中。

取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。

 

参考文献：

[1] Cletus P. Kurtzman, Jack W. Fell. The Yeasts, a Taxonomic Study (4th edition) [M]. 1998

[2] J. A. BARNETT, R. W. PAYNE, D. YARROW. Yeasts: Characteristics and Identification (3rd edition) [M] .2000

[3] P.M. Kirk, P.F. Cannon, J.C. David, J.A. Stalpers. Dictionary of the Fungi(9^th edition) [M].2001

[4] N.J.W Kreger-van Rij.  The Yeasts, a Taxonomic Study (3th edition) [M]. 1984

[5] H.J.法夫等.  酵母菌的生活[M]. 王民俊等译. 贵阳：《酿酒科技》编辑部，1984

[6] J.A.巴尼特，R.W.佩恩，D.亚罗. 酵母菌的特征与鉴定手册[M].　胡瑞卿译. 青岛：青岛海洋大学出版社，1991

[7] 杨文博. 微生物学实验[M]. 北京：化学工业出版社教材出版中心，2004

[8] 杜连祥. 工业微生物学实验技术[M]. 天津：天津科学技术出版社，1992