《自然科技资源收集整理保存技术规程研究制定》项目组

二〇〇四年七月十日

目   次

前 言…………………………………………………………………………………………2

引 言…………………………………………………………………………………………3

1 范围…………………………………………………………………………………………4

2 规范性引用文件……………………………………………………………………………4

3 术语和定义…………………………………………………………………………………4

4 复核菌株的基本信息………………………………………………………………………6

5 存活性检测 (M)……………………………………………………………………………6

6 纯度检测 (M)………………………………………………………………………………6

7 复核鉴定……………………………………………………………………………………6

参考文献……………………………………………………………………………………10

前    言

本规程由自然科技资源平台建设项目提出。

本规程起草单位：中国农业科学院土壤肥料研究所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国兽医药品监察所、中国食品发酵工业研究院。

本规程主要起草人：周宇光、张向民、姜瑞波、顾金刚、朴春根、叶强、张月琴、陈敏、程池等。

引    言

微生物菌种资源的质量控制，包括菌种的存活性、纯度、稳定性和鉴定结果正确性的核查检测，是保存和利用微生物菌种资源的基础。微生物菌种资源种类繁多，需要针对不同的微生物类群建立高效、自动化的形态学、生物化学及分子水平的标准化复核技术体系，在接收和保存菌种的过程中，对其进行必要的证实和检查，及时了解菌株实际状况，为生产和科研提供正确、标准的菌种资源。随着人们对微生物认识的逐步深入，新的、能更好地反映不同微生物类群间自然进化亲缘关系的分类系统不断地取代旧的、人为的分类系统。通过菌种复核，可以及时反映学科的发展变化。

微生物菌种资源的复核是针对那些被正式收录和保藏的菌株所进行的核查。在保证菌株的存活性及纯度的基础上，微生物菌种的复核侧重于对菌种鉴定结果的正确性进行验证性检查。微生物菌种复核检测不同于微生物菌种的鉴定。

本规程针对古菌、细菌、酵母菌、丝状真菌，分别规定了复核的基本内容。

微生物菌种资源复核技术规程

1　范围

本规程规定了古菌、细菌、酵母菌、丝状真菌等微生物菌种在保藏过程中，为保证菌种质量,对各类微生物菌种的存活性、纯度、稳定性的检测，对菌种鉴定结果正确性的复核鉴定，还包括当分类学体系发生变化时所应采取的相应措施。不包括病毒和寄生的微生物。

2　规范性引用文件

下列文件中的条款通过本规程的引用而成为本规程的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程。然而，鼓励根据本规程达成协议的各方，研究是否可以使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本规程。

平台标准：细菌菌种资源描述规范（试行）。

平台标准：古菌菌种资源描述规范（试行）。

平台标准：酵母菌菌种资源描述规范（试行）。

平台标准：微生物菌种纯度检测技术规程 （试行）。

平台标准：微生物菌种资源共性描述规范（试行）。

平台标准：微生物生物危害分级分类规范（试行）。

平台标准：微生物资源分类编码体系（试行）。

3　术语和定义

本规程采用下列术语和定义。

3.1 复核 check

对保藏的各类微生物菌种，在接收和保藏过程中，为保证菌种质量而对鉴定结果进行的核查。包括对菌种活性、纯度、稳定性等的检测，以及采用最新分类学观点对分类地位发生变化的菌种的重新鉴定。

3.2 纯培养 pure culture

由单个细胞的后代组成的培养物，即单细胞培养物或无性繁殖系。通常是由挑取单个菌落或利用单孢分离技术，移种繁殖获得。

3.3 稳定性 stability

菌株的形态、致病性、生化特性、生产性能等特性经保藏后与保藏前的一致性。

3.4 古菌 Archaea

Woese 1990根据核糖体小亚基 rRNA 基因序列分析，构建了泛生命进化树，提出生命的三域学说。该学说将地球生命划分为细菌、古菌和真核生物三域。古菌是一群具有独特的基因结构或系统发育生物大分子序列的单细胞生物，通常生活在地球上极端的生境或生命出现初期的自然环境中，如超高温、高酸碱度、高盐及无氧环境，营自养和异养生活。古菌在细胞大小，结构及基因组结构方面与细菌相似，但其在遗传信息的传递方面更类似于真核生物。古菌中主要包括产甲烷菌、极端嗜盐菌、无细胞壁的和极端嗜热并代谢硫菌。

3.5 细菌 bacterium，复数bacteria

本规范采用广义的细菌概念，指Woese 1990 泛生命树所界定的细菌域中的所有分类群。细菌是一类种类繁多，无处不在的单细胞原核生物。其基本形态为球状、杆状和螺旋状，有些放线菌则形成菌丝体，菌体宽度一般为 0.5-2 微米。大多数细菌具有含肽聚糖的细胞壁。细菌通常是以二分裂法进行增殖，间或出现一些不等分裂和出芽的种类。有一部分细菌还形成芽孢。细菌的遗传结构可通过突变、接合、转导或转化发生改变。其营养要求各不相同，代谢方式也各具其特征。

3.6 酵母菌 yeast

指那些主要以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的真菌，其营养阶段主要以单细胞状态存在，有性阶段不形成子实体。

3.7 丝状真菌 filamentous fungi

在本规范中指除酵母菌外所有可培养的真菌。包括：接合菌、子囊菌、担子菌、无性型真菌及卵菌中可培养的类群。

3.8 分类单元（也称分类群，Taxon, 复数Taxa）

分类单元不是指分类系统中的一个“类目”，而是可以用来指任何等级的分类群。

4　复核菌株的基本信息

复核菌株的基本信息为必备要素。(M)

复核记录应标明所复核菌株的以下基本信息：保藏中心名称、保藏方式、菌株保藏编号、菌株名称（原定名）、复核日期、复核内容及结果（所进行的实验项目及各项实验结果）、复核结论、复核人员姓名、中心负责人签字以及需要补充说明的有关内容。

5　存活性检测 (M)

存活性检测是所有微生物菌株复核的必备要素。

该项检测应将采用不同保藏方法保存的培养物接种于适当的培养基，在合适的条件下培养，检查其保藏后的生长情况，确定适用的长期保藏技术方法。

6　纯度检测 (M)

纯度检测是所有微生物菌种复核的必备要素。

规定以下两种检测方法同时进行。

——显微镜观察，全部的细胞个体形态相似，染色反应一致。（或与原纯菌的描述一致）

——将培养物制成悬液，重新倾注平板，或平板划线培养后，所形成的全部菌落形态一致或相似。

具体方法参照平台标准《微生物菌种纯度检测技术规程 （试行）》。

7　复核鉴定

7.1　古菌的复核鉴定

古菌菌种的复核鉴定应根据不同类群的主要特征，选择最能反映该类群有别于其他分类群的特征来进行。包括：细胞形态、营养类型、氧的需求、以及对温度、酸、碱、盐的需求和耐受性等理化特性试验、细胞膜脂成分分析等。

序列测定为复核的非必备要素。当需要复核的菌种缺少序列测定数据时，应将16S rDNA序列测定作为复核鉴定的内容之一。

7.2　细菌的复核鉴定

针对具体类群，从以下几个方面选择有代表性、鉴别性的特征特性进行复核鉴定。

——显微形态观察：如细胞形状、鞭毛、芽孢以及放线菌的菌丝、孢子丝和孢子的观察；革兰氏染色和抗酸染色反应等。

——培养特性：水溶性色素和非水溶性色素的观察，其它特定培养特征的观察。

——细胞化学组分分析：对于放线菌和部分高G+C mol% 革兰氏阳性细菌应对细胞壁化学组分进行必要的分析，包括细胞壁二氨基酸分析和糖型分析。

序列测定为复核的非必备要素。当需要复核的菌种缺少序列测定数据时，应将16S rDNA序列测定作为复核鉴定的内容之一。

7.3　酵母菌的复核鉴定

对于多数常用或常见的酵母菌，可依据表型信息对鉴定结果的正确性进行核查。

——培养特性：菌落质地、颜色、高度、生长速度，对温度的适应范围等。

——显微形态观察：如细胞大小和形态、无性繁殖方式、假菌丝形成与否；有性生殖方式、子囊孢子或担孢子的形态特征。

——生理生化特征：可采用基于数值分类鉴定原理的微量多项试验鉴定系统，或通过手工配制生理生化特性鉴定培养基，检测菌种的理化特性。

序列测定为复核的非必备要素。当需复核的菌种缺少序列测定数据时，应将测定26S rDNA D1/D2和ITS 区的碱基序列作为复核鉴定的内容之一。

7.4　丝状真菌的复核鉴定

丝状真菌的复核鉴定主要依据不同分类群的培养特征和显微形态特征。

7.4.1　接合菌菌种的复核鉴定

接合菌菌种的复核鉴定主要根据以下所列接合菌的分类依据进行。

——培养特性：菌落（菌丛）质地、颜色、生长速度、气生菌丝高度，对温度的适应范围， 尤其是最高和最低生长温度。

——营养体细胞的构造：菌丝隔膜产生情况，假根的有无，发达程度及其着生方式。

——无性繁殖特征：孢囊梗长短、簇生或单生，不分枝或分枝，分枝的类型，直立或弯曲；孢囊形状、大小，内含孢囊孢子的数量，囊壁消解与否；囊轴形状、大小， 颜色；囊托的有无、形状、大小；孢囊孢子形状、大小、表面纹饰、附属丝的有无；厚垣孢子的有无。

——有性生殖特征：接合孢子是同宗还是异宗配合，配囊柄对生或并生，配囊柄形状、大小。

7.4.2　子囊菌菌种的复核鉴定

主要指那些可培养，并在培养过程中容易产生有性型的子囊菌类群。如：红曲属（Monascus）、

脉孢菌属(Neurospora)、毛壳菌属（Chaetomium）等。这些类群的复核鉴定应主要依据以下形态特征。            

——菌落形态特征：菌落质地、生长速度、菌丝体颜色、色素的产生情况、菌落反面的颜色等。

——体细胞的构造：菌丝分隔、分枝情况，菌丝内含物的有无等。

——无性繁殖特征：分生孢子梗、产孢细胞、分生孢子的形态特征（大小、颜色，着生方式）。

——有性生殖特征：闭囊壳或子囊壳的形态特征（大小、颜色，表面附属物的形态特征）；子囊的形态特征及其结构（排列方式，形态、大小，成熟后其壁的消解情况）；子囊孢子的形态特征（颜色、形态、大小、表面纹饰）。

7.4.3　担子菌菌种的复核鉴定

由于这类菌有其特有的栽培特性和直接的商品生产价值，对这类菌的复核，除培养特征外，还应对其农艺性状和商品性状进行检验。具体包括以下内容：

——培养特征：菌落生长速度、子实体发育动态。

——体细胞的构造：有无锁状联合、菌丝体类型。

——成熟子实体的形态特征：菌盖、菌柄、菌环、菌托、菌褶和菌管、菌肉（菌髓）。

——有性生殖体形态特征：担子的类型、担孢子形态、颜色、大小及表面纹饰。

7.4.4　无性型真菌分类群的复核鉴定

指那些在培养过程中一般不产生有性型以及尚未发现其相应的有性型的丝状真菌。如：青霉属（Penicillium）、 曲霉属（Aspergillus）、 木霉属（Trichoderma）等。对这些类群的复核鉴定主要包括对其菌落形态特征及显微特征的观察和比较。

——菌落形态特征：菌落质地、颜色、生长速度，色素的产生情况、渗出液、气味的有无，菌落反面的颜色等。

——菌体形态特征：菌丝分隔、分枝情况，菌丝内含物的有无等（主要指无孢菌群）。

——无性繁殖体形态特征：分生孢子梗发生部位、分枝情况；分生孢子头的形状；分生孢子产生方式、形状、大小、颜色、表面情况（光滑或具不同的纹饰）；厚垣孢子的有无及其形状、大小、颜色。以及是否产生特殊的分生孢子结构，如：孢梗束、分生孢子座等。

7.4.5　卵菌菌种的复核鉴定

卵菌各分类群的复核鉴定主要依据以下形态特征。

——培养特征：在固体培养基上菌落形态，对温度的适应范围，最适生长温度。

——体细胞的构造：菌丝体发达与否、分枝情况、菌丝宽度、孢囊梗与菌丝有无明显区别等。

——无性繁殖体形态特征：孢子囊形态、孢子囊萌发时是否产生泡囊；孢囊梗形状与分枝情况；游动孢子形成方式、形态，是否具两游现象；厚垣孢子的有无。

——有性生殖体形态特征：同宗配合或异宗配合，藏卵器的形态、结构，雄器的产生方式和形态。

参考文献

[1] 刘志恒，姜成林主编。2004年。放线菌现代生物学与生物技术。北京：科学出版社。1-353.

[2] 陆家云主编。2000年。植物病原真菌学。北京：中国农业出版社。1-535.

[3] 姚一建、李玉主译。2002年。菌物学概论。北京：中国农业出版社。1-771. 

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[13] Kurtzman C.P. & Fell J.W. 1998. The Yeast. A Taxonomic Study. (Fourth Revised and Enlarged Edition.) Elsevier Science B.V. Amsterdam.